mutectcaller
此工具是 GATK 体细胞变异检出器 Mutect2 的加速版本，它接受来自 FQ2BAM 工具的比对 BAM 文件，并输出 VCF 文件。它可以接受单个（“仅肿瘤”）BAM 或一对 BAM（“肿瘤-正常”）作为输入，以提供基线来检测体细胞变异。
下图显示了 mutectcaller 的高级功能。所有虚线框表示可选数据，但有一些约束。
肿瘤样本的名称（对于 --tumor-name 选项）和正常样本的名称（对于 --normal-name 选项）可以从各自 BAM 文件的标头中提取，使用 samtools，可以通过 apt-get 安装 samtools。
$ sudo apt-get install samtools
或者，您可以按照 samtools 仓库 中的说明从源代码构建它。
在您的系统上安装 samtools 后，您可以运行此命令来获取样本名称 (SM) 字段
$ samtools view NA12878.bam -H | grep '@RG'
@RG ID:HJYFJ.4 SM:NA12878 LB:Pond-492093 PL:illumina PU:HJYFJCCXX160204.4.GCCGCAAC CN:BI DT:2016-02-04T00:00:00-0500
样本名称是 "SM:" 之后的值（在本例中为 NA12878）
如果存在多个读取组 (@RG) 行，并且所有行都具有相同的样本名称，您可以安全地使用通用样本名称。如果存在具有多个样本名称的多个读取组行，请选择一个样本名称作为输入。具有该样本名称的所有读取都将由 mutectcaller 处理，所有其他读取将被忽略。目前，每个 BAM 文件仅支持一个样本名称。
如果 BAM 标头中没有读取组行，或者读取组行中没有样本名称，您将需要向 BAM 文件添加读取组信息。这可以通过运行此命令来完成
$ samtools addreplacerg \
-r "@RG\tID:sample_rg1\tLB:lib1\tPL:bar\tSM:sample_sm\tPU:sample_rg1" \
original_file.bam \
-o updated_file.bam \
-O BAM
这将把此 BAM 文件中所有读取的样本名称更新为 "sample_sm"，您可以将 "sample_sm" 作为此 BAM 文件的样本名称传递。确保使用 updated_file.bam 作为 mutectcaller 的输入。
有关所有可用选项的详细列表，请参阅 mutectcaller 参考 部分。
您可以从此处下载 mutect 样本数据集。通过运行以下命令解压所有文件
$ tar -xvzf mutect_sample.tar.gz
mutect_sample/
mutect_sample/germline_resource.vcf.gz.tbi
mutect_sample/force_call.vcf.gz.tbi
mutect_sample/germline_resource.vcf.gz
mutect_sample/tumor.bam.bai
mutect_sample/GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fa
mutect_sample/force_call.vcf.gz
mutect_sample/tumor.bam
mutect_sample/normal.bam.bai
mutect_sample/normal.bam
在 mutect_sample 文件夹中，您将找到必要的输入文件，包括
一个参考 FASTA 文件 (GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fa)，
一个肿瘤 BAM 文件 (tumor.bam)，
一个正常 BAM 文件 (normal.bam)，
一个 force_calling.vcf.gz VCF 文件和
一个 germline_resource.vcf.gz VCF 文件
以及所有必要的索引。
# This command assumes all the inputs are in INPUT_DIR and all the outputs go to OUTPUT_DIR.
docker run --rm --gpus all --volume INPUT_DIR:/workdir --volume OUTPUT_DIR:/outputdir \
--workdir /workdir \
nvcr.io/nvidia/clara/clara-parabricks:4.4.0-1 \
pbrun mutectcaller \
--ref /workdir/${REFERENCE_FILE} \
--tumor-name tumor_name_inside_bam_file \
--in-tumor-bam /workdir/${INPUT_TUMOR_BAM} \
--in-normal-bam /workdir/${INPUT_NORMAL_BAM} \
--normal-name normal_name_inside_bam_file \
--out-vcf /outputdir/${OUTPUT_VCF}
以下命令是上述 Parabricks 命令的 GATK4 对应命令。此命令的输出将与上述命令的输出相同。有关结果比较，请参阅输出比较页面。
$ gatk Mutect2 \
-R <INPUT_DIR>/${REFERENCE_FILE} \
--input <INPUT_DIR>/${INPUT_TUMOR_BAM} \
--tumor-sample tumor_name_inside_bam_file \
--input <INPUT_DIR>/${INPUT_NORMAL_BAM} \
--normal-sample normal_name_inside_bam_file \
--output <OUTPUT_DIR>/${OUTPUT_VCF}
Parabricks Mutect2 从 3.7.0-1 版本开始支持 Panel of Normals 来处理变异。涉及三个步骤
prepon
使用 prepon 生成的索引运行 mutectcaller
postpon，使用 PON 信息更新 VCF
# The first command will generate input.pon that should be done once for the input.vcf.gz
# This command assumes all the inputs are in INPUT_DIR and all the outputs go to OUTPUT_DIR.
docker run --rm --gpus all --volume INPUT_DIR:/workdir --volume OUTPUT_DIR:/outputdir \
--workdir /workdir \
nvcr.io/nvidia/clara/clara-parabricks:4.4.0-1 \
pbrun prepon --in-pon-file /workdir/${INPUT_PON_VCF}
# Run mutectcaller with the pon index
# This command assumes all the inputs are in INPUT_DIR and all the outputs go to OUTPUT_DIR.
docker run --rm --gpus all --volume INPUT_DIR:/workdir --volume OUTPUT_DIR:/outputdir \
--workdir /workdir \
nvcr.io/nvidia/clara/clara-parabricks:4.4.0-1 \
pbrun mutectcaller \
--ref /workdir/${REFERENCE_FILE} \
--tumor-name tumor \
--in-tumor-bam /workdir/${INPUT_TUMOR_BAM} \
--in-normal-bam /workdir/${INPUT_NORMAL_BAM} \
--pon /workdir/${INPUT_PON_VCF} \
--normal-name normal \
--out-vcf /outputdir/${OUTPUT_VCF}
# Add the annotation to the output.vcf generated above
# This command assumes all the inputs are in INPUT_DIR and all the outputs go to OUTPUT_DIR.
docker run --rm --gpus all --volume INPUT_DIR:/workdir --volume OUTPUT_DIR:/outputdir \
--workdir /workdir \
nvcr.io/nvidia/clara/clara-parabricks:4.4.0-1 \
pbrun postpon \
--in-vcf /workdir/${OUTPUT_VCF} \
--in-pon-file /workdir/${INPUT_PON_FILE} \
--out-vcf /outputdir/${OUTPUT_ANNOTATED_VCF}
虽然与 GATK MutectCaller 相比，Parabricks MutectCaller 在功能上不会降低任何准确性，但仍有一些实现差异可能会导致略有不同的输出文件。
Log10 实现
log10 操作用于计算单倍型惩罚分数。Java 实现 java.lang.Math.log10() 与 C++ cmath 库略有不同，导致计算分数略有不匹配。由于这个原因，可能会选择不同的单倍型。
AVX
GATK 调用 Intel GKL（基因组内核库），其中包含计算内核（例如 Smith-Waterman、PairHMM）的优化版本，以在 Intel 架构（AVX、AVX2、AVX-512 和多核）上运行。但是，与我们的 GPU 实现所基于的串行操作相比，某些 SIMD 内在函数（例如 _mm512_mul_ps）可能会生成略有不同的输出。
HashMap、HashSet 迭代
GATK 可能会给出不确定的输出，因为迭代 Java HashMap 或 HashSet 不会保留顺序。Parabricks 始终通过使用保留插入顺序的哈希表（类似于 Java 中的 LinkedHashMap）来提供确定性输出。
运行 GPU mutect2 以将 BAM/CRAM 转换为 VCF。
输入/输出文件选项
- --ref REF
-
参考文件的路径。（默认值：None）
此选项为必选项。
- --out-vcf OUT_VCF
-
变异检出后 VCF 文件的路径。（默认值：None）
此选项为必选项。
- --in-tumor-bam IN_TUMOR_BAM
-
肿瘤读取的 BAM/CRAM 文件的路径。（默认值：None）
此选项为必选项。
- --in-normal-bam IN_NORMAL_BAM
-
正常读取的 BAM/CRAM 文件的路径。（默认值：None）
- --in-tumor-recal-file IN_TUMOR_RECAL_FILE
-
肿瘤样本碱基质量分数重校准后的报告文件路径。（默认值：None）
- --in-normal-recal-file IN_NORMAL_RECAL_FILE
-
正常样本碱基质量分数重校准后的报告文件路径。（默认值：None）
- --interval-file INTERVAL_FILE
-
间隔文件的路径，格式为以下格式之一：Picard 样式（.interval_list 或 .picard）、GATK 样式（.list 或 .intervals）或 BED 文件 (.bed)。此选项可以多次使用。（默认值：None）
- --mutect-bam-output MUTECT_BAM_OUTPUT
-
应写入组装单倍型的文件。如果使用 --run-partition 传递，将输出多个 BAM 文件。（默认值：None）
- --pon PON
-
vcf.gz PON 文件的路径。确保您首先运行 prepon，并且已存在 '.pon' 文件。（默认值：None）
- --mutect-germline-resource MUTECT_GERMLINE_RESOURCE
-
vcf.gz 种系资源文件的路径。包含等位基因分数的种系测序群体 VCF。（默认值：None）
- --mutect-alleles MUTECT_ALLELES
-
vcf.gz 强制调用文件的路径。要强制调用的等位基因集，无论证据如何。（默认值：None）
工具选项
- --max-mnp-distance MAX_MNP_DISTANCE
-
两个或多个由该距离或更小距离分隔的定相取代合并为 MNP。（默认值：1）
- --mutectcaller-options MUTECTCALLER_OPTIONS
-
将支持的 mutectcaller 选项作为字符串传递。目前支持以下原始 mutectcaller 选项：-pcr-indel-model <NONE, HOSTILE, AGGRESSIVE, CONSERVATIVE>、-max-reads-per-alignment-start <int>，（例如 --mutectcaller-options="-pcr-indel-model HOSTILE -max-reads-per-alignment-start 30"）。（默认值：None）
- --initial-tumor-lod INITIAL_TUMOR_LOD
-
考虑堆积激活的 Log 10 优势阈值。（默认值：None）
- --tumor-lod-to-emit TUMOR_LOD_TO_EMIT
-
将变异体发射到 VCF 的 Log 10 优势阈值。（默认值：None）
- --pruning-lod-threshold PRUNING_LOD_THRESHOLD
-
自适应剪枝算法的 Ln 似然比阈值。（默认值：None）
- --active-probability-threshold ACTIVE_PROBABILITY_THRESHOLD
-
位点被视为激活的最小概率。（默认值：None）
- --no-alt-contigs
-
忽略常见的替代 contigs。（默认值：None）
- --genotype-germline-sites
-
调用所有明显的种系位点，即使它们最终会被过滤掉。（默认值：None）
- --genotype-pon-sites
-
调用 PoN 中的位点，即使它们最终会被过滤掉。（默认值：None）
- --force-call-filtered-alleles
-
强制调用 --alleles 指定的资源中包含的已过滤等位基因。（默认值：None）
- --filter-reads-too-long
-
忽略所有大小 > 500bp 的输入 BAM 读取。（默认值：None）
- --tumor-name TUMOR_NAME
-
肿瘤读取样本的名称。这必须与肿瘤 BAM 文件中的 SM 标签匹配。（默认值：None）
此选项为必选项。
- --normal-name NORMAL_NAME
-
正常读取样本的名称。如果指定，则必须与正常 BAM 文件中的 SM 标签匹配。（默认值：None）
- -L INTERVAL, --interval INTERVAL
-
从 BAM/CRAM 文件中调用变异的区间。所有区间都将具有 100 的填充以获取读取记录，并且重叠的区间将被组合。间隔文件应使用 --interval-file 选项传递。此选项可以多次使用（例如 "-L chr1 -L chr2:10000 -L chr3:20000+ -L chr4:10000-20000"）。（默认值：None）
- -ip INTERVAL_PADDING, --interval-padding INTERVAL_PADDING
-
要添加到您包含的每个区间的填充量（以碱基对为单位）。（默认值：None）
性能选项
- --mutect-low-memory
-
在 mutect 调用器中使用低内存模式。（默认值：None）
- --run-partition
-
打开分区模式；将基因组划分为多个分区，每个分区运行 1 个进程。（默认值：None）
- --gpu-num-per-partition GPU_NUM_PER_PARTITION
-
每个分区要使用的 GPU 数量。（默认值：None）
- --num-htvc-threads NUM_HTVC_THREADS
-
要使用的 CPU 线程数。（默认值：5）
常用选项
- --logfile LOGFILE
-
日志文件的路径。如果未指定，消息将仅写入标准错误输出。（默认值：None）
- --tmp-dir TMP_DIR
-
将存储临时文件的目录的完整路径。
- --with-petagene-dir WITH_PETAGENE_DIR
-
PetaGene 安装目录的完整路径。默认情况下，这应已安装在 /opt/petagene。使用此选项还需要通过设置 LD_PRELOAD 环境变量预加载 PetaLink 库。可以选择设置用于数据和凭据的 PETASUITE_REFPATH 和 PGCLOUD_CREDPATH 环境变量（默认值：None）
- --keep-tmp
-
完成操作后，不要删除存储临时文件的目录。
- --no-seccomp-override
-
不要覆盖 docker 的 seccomp 选项（默认值：None）。
- --version
-
查看兼容的软件版本。
GPU 选项
- --num-gpus NUM_GPUS
-
运行要使用的 GPU 数量。将使用 GPU 0..(NUM_GPUS-1)。